第二代測序（Next-generation sequencing，NGS）又稱為高通量測序（High-throughput sequencing），是基于PCR和基因芯片發展而來的DNA測序技術。相比于一代測序的合成終止測序方法，二代測序開創性地引入了可逆終止末端，可以實現邊合成邊測序。二代測序在DNA復制過程中通過捕捉新添加的堿基所攜帶的特殊標記（一般為熒光分子標記）來確定DNA的序列，現有的二代測序技術平臺主要包括Ion torrent、Illumina和華大MGI平臺等。由于在二代測序中，單個DNA分子必須擴增成由相同DNA組成的基因簇，然后進行同步復制，來增強熒光信號強度從而讀出DNA序列；而隨著讀長增長，基因簇復制的協同性降低，導致堿基測序質量下降，這嚴格限制了二代測序的讀長（不超過500bp），因此，二代測序具有通量高、讀長短的特點。目前二代測序（NGS）主要包括宏基因組二代測序技術（metagenomics next-generation sequencing, mNGS）和病原靶向測序技術（Targeted Next-generation Sequencing，tNGS）。 mNGS是借助二代測序平臺快速測序獲得樣品中的核酸序列，并進一步與各個物種的基因組序列對比，從而得知樣品中微生物的種類和比例的技術。mNGS具有檢測全面，準確率高，敏感度高和時間短的優勢。鑒定樣品中病原微生物時，mNGS可以補充或替代傳統的生化、免疫和培養方法，更快更加準確地取得結果。更重要的是，傳統方法在應對少見、罕見感染，新發性感染時常常束手無策，mNGS通過檢測樣品中全微生物物種，從而找出潛在的致病微生物，指導用藥。同時mNGS有一定的局限性。首先，由于臨床樣本中人源核酸的占比較高，導致病原微生物檢測靈敏度降低，也使得其耐藥、毒力基因存在漏檢風險。其次，由于mNGS測序是隨機片段測序，測序時未必覆蓋分型區段，可能導致近源病原體無法精準分型。

tNGS是一種只針對特定基因序列進行高通量測序的技術，通過大量針對特定基因序列的引物探針對待測樣品中抽提出的核酸進行超多重PCR擴增/探針捕獲，獲得大量目標核酸片段，再對這些目標核酸片段進行高通量測序，然后對所得序列進行生信分析，從而實現對待測樣本中的核酸進行高靈敏以及高分辨率的識別。靶向富集（Target enrichment）是tNGS技術的關鍵環節，通過對目標基因組區域（regions of interest ，ROI）進行富集，確保ROI區域有足夠的測序深度和覆蓋度，進而成功地識別目標病原體。目前國內外策略主要分為兩種：基于超多重PCR擴增的tNGS和基于雜交捕獲的tNGS 。相比mNGS，tNGS有以下技術優勢：1.富集增加目標微生物檢測覆蓋，提升檢測可信度；2. NGS可穩定的進行耐藥或毒力基因的檢測；3. tNGS檢測因目標病原體設定范圍明確，可以顯著簡化解讀流程。但是tNGS也有一定的局限性，tNGS的檢測panel是依據已知病原設計的，因此tNGS不適用于新發病原的檢測。

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